文章来源:陈哲文,石汉平,缪明永,余亚英,张启瑜.低糖与甘露糖协同抑制胰腺肿瘤生长.肿瘤防治研究2020,47(5):319-323.
正 文
随着肿瘤营养学的兴起，通过特殊饮食抗肿瘤的营养疗法越来越受到关注[1]。有研究发现，甘露糖能够抑制肿瘤的生长，增强化疗药物的效果，不同肿瘤敏感度的差异与甘露糖-6-磷酸异构酶（mannose-6-phosphate isomerase, PMI）的表达有关[2]。
肿瘤细胞以有氧糖酵解为主要能量来源，糖酵解速度远高于正常组织，称为Warburg效应[3]。降低血糖，减少葡萄糖供应，理论上可以特异性阻断肿瘤细胞的能量来源，从而抑制肿瘤细胞的生长。禁食及能量限制的饮食方式均能够降低机体葡萄糖水平，从而起到抗肿瘤的效果[1]。同时，低糖环境可能会增强如二甲双胍等药物的抗肿瘤作用[4-5]，甘露糖的抗肿瘤作用与糖代谢密切相关，降低培养基的葡萄糖浓度可能增强肿瘤细胞对甘露糖的敏感度。
本研究通过体内与体外实验，观察不同葡萄糖浓度处理下的胰腺肿瘤细胞的增殖与PMI蛋白表达的变化，在荷瘤鼠模型中选择高脂低糖的生酮饮食来降低裸鼠血糖水平，探讨生酮饮食（keto-genic diet, KD）与甘露糖联合应用的抗肿瘤疗效。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
人胰腺癌细胞AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、 SW1990均购自中国科学院上海细胞库，用DMEM培养基（含10%胎牛血清和100 u/ml的青霉素、100 μg/ml链霉素，美国Gibco公司，C11995500BT）培养于5%CO?、37℃培养箱中，隔天换培养液，胰蛋白酶消化传代。
1.2 细胞增殖检测
将2×103个AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、 SW1990胰腺癌细胞分别接种于不同的96孔板中， 细胞贴壁后，更换不同浓度葡萄糖（25、10、2.5 mmol/L）的培养基并加入浓度梯度的甘露糖（Sigma-Aldrich, M2069），每组重复3次，培养4天（每2天更换培养基）后加入10 μl CCK-8溶液 （同仁，CK04)，并于培养箱中孵育2 h后以酶标仪测定450 nm处的吸光度。
1.3 蛋白印迹实验（Western blot）
以RIPA蛋白裂解液（上海碧云天，P0013）提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，4:1加入蛋白上样缓冲液沸水浴变性5 min，印迹到PVDF膜（美国Millipore, IPVH00010）上。使用PMI的特异性抗体（美国Proteintech, 14234-1-AP）和β-actin（上海雅酶生物，LF202）4℃孵育过夜后，兔二抗（上海雅酶生物，LF102）常温2 h， ECL化学发光法曝光条带。
1.4 细胞存活率检测
将2×104个细胞接种于12孔板中，各孔板含不同葡萄糖浓度的培养基，实验组含有25 mmol/L甘露糖，继续培养48 h后，按锥虫蓝染色细胞存活率检测试剂盒（上海碧云天，C0011）说明书操作，并用细胞计数仪（Nexcelom Cellometer Auto 2000）测各组细胞存活率。
1.5 裸鼠皮下移植瘤模型建立及干预
32只裸鼠适应性喂养1周后，取对数生长期的胰腺癌细胞BxPc-3，用无血清培养基调整细胞浓度为2×106 个/200微升[6]，将细胞悬液200 μl接种于 裸小鼠的右后支背部皮下。当肿瘤体积约100 mm3时，用游标卡尺测量肿瘤直径，用公式V=ab2π/6 （a为最长直径，b为最短直径）计算肿瘤体积， 并随机分成四组：正常饮食（standard diet, SD）组、SD+甘露糖（mannose, Man）组、KD（深圳奇酮公司）组以及KD+Man组，其中Man组与 KD+Man组分别以饮用水配制20%和10%甘露糖水溶液的方式喂养。根据前期预实验结果，KD组用量为125 g/kg，SD组不限量，小鼠每日摄取的总能量相近，SD与KD组具体营养配比见表1。实验过程中使用雅培血糖仪尾静脉取血检测血糖、血酮水平。
1.6 统计学方法
采用SPSS23.0和Graphpad Prism 8.2软件进行统计学分析。计量资料数据用（x±s）表示，配对样本t检验比较瘤重和血糖血酮水平。P
